72568 - BIOCHIMICA DELLA SEGNALAZIONE CELLULARE CON LABORATORIO

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite dei principali meccanismi biochimici di segnalazione intracellulare e dell'interazione funzionale tra organelli. Acquisisce inoltre esperienza pratica delle tecniche di coltivazione di cellule in vitro, delle metodologie per determinare la vitalità/morte cellulare e per analizzare le funzioni cellulari in singola cellula in vivo mediante sonde fluorescenti. In particolare, lo studente è in grado di: - analizzare e discutere con padronanza argomenti di biochimica cellulare; - definire le metodologie da utilizzare per risolvere problemi biologici specifici.

Contenuti

Rivisitazione dei mitocondri. Il genoma mitocondriale e le malattie mitocondriali. Ruolo delle mutazioni del genoma mitocondriale nella tumorigenesi: implicazione del fattore di trascrizione HIF-1alfa.  Effetto Warburg e nuove acquisizioni sulla "trasformazione metabolica" nei tumori.  Caratteristiche ultrastrutturali dei mitocondri e implicazioni funzionali. Eterogeneità morfologica e funzionale del reticolo mitocondriale; studi in vivo mediante sonde e proteine fluorescenti ricombinanti. Le proteine della dinamica mitocondriale: Drp1, mitofusine e OPA1: struttura e regolazione. PINK e Parkina. Ruolo nell'apoptosi e autofagia.

I secondi messaggeri: AMP ciclico, struttura e isoforme delle adenilato ciclasi e fosfodiesterasi. Misure di AMP ciclico in vivo mediante proteine ricombinanti fluorescenti. PKA, EPAC e AKAP.

Concetto di "calcium-signalling toolkit"; trasportatori e canali delle membrane cellulari; Struttura dei recettori per IP3 e rianodinico. I messaggeri intracellulari cADPR e NAADP: biosintesi e funzione. Aspetti temporali e  spaziali della segnalazione di calcio: onde, oscillazioni e meccanismi ipotizzati.  Entrata capacitativa di calcio nella membrana plasmatica: ruolo delle proteine Stim e Orai. Calcio nei mitocondri: uniporto e scambiatori; misure di calcio nella matrice mediante mt-aequorina; dimostrazione dell'esistenza di microdomini di calcio ER-mitocondri. Proteine coinvolte nelle relazioni ER-mitocondri. Calcio mitocondriale e metabolismo cellulare.

I recettori a 7 eliche transmembrana:  caratteristiche e classificazione; strategie di segnalazione indipendenti da proteine G. Inattivazione recettoriale: le GRK e le beta-arrestine. Recettori chimerici di classe A e B: segnalazione,  traffico intracellulare  e attivazione delle MAP chinasi. Trans-attivazione dei recettori tirosina chinasici, crosstalk con recettori insulina e IGF1-R. .

Nel laboratorio sperimentale ogni studente eseguirà una serie di esperimenti in cui imparerà le metodologie di base per identificare e caratterizzare disfunzioni mitocondriali,  utilizzando cellule in coltura. 

Gli esprimenti consistono in: 1. Tripsinizzazione, conta e semina di cellule adese; 2. Determinazione del contenuto proteico; 3. Misura della velocità della glicolisi anaerobica; 4. Analisi della morfologia e del potenziale mitocondriale in vivo mediante microscopia a fluorescenza in singola cellula: 5. Valutazione della produzione di specie reattive dell'ossigeno in cellule intatte; 6. Determinazione della vitalità cellulare dopo stress metabolico; 7. Identificazione di una mutazione del mtDNA in cellule umane: estrazione del DNA genomico, amplificazione del mtDNA, digestione e separazione mediante elettroforesi su gel di agarosio.  

Testi/Bibliografia

Il docente fornità le indicazioni bibliografiche (rassegne e lavori originali). I files PDF con il materiale illustrato durante le lezioni saranno a disposizione degli studenti, previa iscrizione alla lista di distribuzione del docente e accesso al sito AMS Campus, utilizzando la password fornita dal docente.

Metodi didattici

Durante le lezioni verranno discusse alcune importanti problematiche della segnalazione cellulare. Il corso teorico è affiancato da un laboratorio sperimentale, in cui ciascun studente potrà effettuare una serie di esperimenti semplici, imparando le metodologie di base per lo studio delle funzioni cellulari, quali spettrofotometria, microscopia ottica e a fluorescenza, elettroforesi, etc. Imparerà inoltre le procedure fondamentali per manipolare e propagare cellule in coltura.  Queste attività saranno programmate in modo che lo studente possa realizzare praticamente le soluzioni dei alcuni problemi delineati in forma teorica durante le lezioni.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

La prova di verifica dell'apprendimento é orale e prevede una serie di domande, che tenderanno ad accertare la conoscenza da parte dello studente degli argomenti svolti a lezione.

Per quanto riguarda la verifica dell'apprendimento della parte riguardante il laboratorio sperimentale, si effettuerà un test scritto, che  consiste in 5 quesiti, che fanno riferimento alle metodologie e alle procedure eseguite nelle esperienze di laboratorio.

Strumenti a supporto della didattica

presentazioni ppt; lavori scientifici

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Michela Rugolo